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IHC 实验操作步骤

免疫组化方法(石蜡切片)

转自CST中国 CST博士互助平台

*重要提示:参考抗体说明书选用合适的抗体稀释液和抗原修复处理方法。IHC方法:抗原修复缓冲液/抗体稀释液

A.     所需溶液和试剂

1. 二甲苯

2. 无水乙醇(100% 95%,变性无水乙醇,组织学级)

3. 去离子水(dH2O

4. 苏木精(可选)

5. 漂洗(缓冲)液:

1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST)配制时,取100 ml 10X TBS900 ml水稀释至1升。加入1 ml Tween-20,混匀。

10X Tris缓冲盐水(10X TBS)800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Trizma base, C4H11NO3)和80 g 氯化钠(NaCl)。用浓盐酸将pH调节到7.6,定容至1 L

6. *抗体稀释液

a. SignalStain® 抗体稀释液 #8112

b. TBST / 5%正常山羊血清: 5 ml 1 X TBST 中添加250 µl正常山羊血清。

c. PBST / 5%正常山羊血清: 5 ml 1 X PBST 中添加250 µl正常山羊血清。

1 X PBS / 0.1% Tween-20 (1 X PBST): 配制时,取100 ml 10X PBS900 ml水稀释至1 L。加入1 ml Tween-20,混匀。

10X 磷酸盐缓冲液 (10X PBS): 800 ml水中加入80 g 氯化钠(NaCl, 2 g 氯化钾(KCl, 14.4 g 磷酸氢二钠(Na2HPO4)和2.4 g 磷酸二氢钾(KH2PO4)。调整pH7.4,定容至1 L

7. *抗原修复:

a. 柠檬酸盐:10 mM柠檬酸盐缓冲液:称取2.94g二水合柠檬酸钠(C6H5Na3O7•2H2O)溶解在800 ml水中。调整pH6.0,定容至1 L

b. EDTA: 1mM EDTA: 称取0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 溶解在800 ml水中。调整pH8.0,定容至1 L

c. TE10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 9.0: 配制时,称取1.21 g Trizma®碱(C4H11NO3)和0.372 g EDTA (C10H14N2O8Na2•2H2O) 溶解在950 ml蒸馏水中。调整pH9.0,然后用蒸馏水定容至到1 L

d. 胃蛋白酶:1 mg/ml,溶解在pH2.0Tris盐酸缓冲液中。

8. 3%过氧化氢:配制时,将10 ml 30% H2O2加入到90 ml蒸馏水中。

9. 封闭液:TBST/5%正常山羊血清:5 ml 1X TBST中添加250 µl正常山羊血清。

10. 检测系统:根据厂家说明书使用。已有的检测系统:

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125

注意如果本产品没有使用本试剂优化过,可能需要通过滴定法来确定最佳条件。

11. DAB试剂或合适的底物:按产品说明配制。

 

B.      脱蜡处理/再水化

注意:操作中任何时候都不要晾干玻片

1. 脱蜡处理/切片的水化:

a.       用二甲苯浸洗切片3次,每次5分钟。

b.       用无水乙醇浸洗切片2次,每次10分钟。

c.       95%乙醇浸洗切片2次,每次10分钟

2. 在蒸馏水中漂洗2次,每次5分钟。

 

C.     *抗原修复

注意:参考抗体说明书选用合适的抗原修复缓冲液,按以下步骤操作。

1. 柠檬酸缓冲液处理:加热浸泡在10 mM pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液中的玻片,使之维持在准沸腾的温度(95-99°C10分钟。取出放在实验台上自然冷却30分钟。

2. EDTA处理:加热浸泡在1 mM pH 8.0 EDTA溶液中的玻片,使之维持在准沸腾的温度(95-99°C15分钟。不需另加冷却步骤。

3. TE处理:加热浸泡在pH 9.010 mM TE/1 mM EDTA溶液中的玻片,使之维持在准沸腾的温度(95-99°C18分钟。取出放在实验台上自然冷却30分钟。

4. 胃蛋白酶处理:37°C消化10分钟。

 

D.     染色

注意:查询产品说明书推荐的抗体稀释比例。

1. 切片用漂洗液洗两次,每次5分钟。

2. 浸泡在3% H202中孵育10分钟

3. 用蒸馏水漂洗两次,每次5分钟。

4. 用漂洗液洗5分钟

5. 在切片上滴加100-400 μl封闭液,室温封闭1小时。

6. 去掉封闭液,每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。

7. 去掉抗体稀释液。用漂洗液洗3次,每次5分钟。

8. 根据厂家说明书,用合适的检测系统检测。

9. 用漂洗液洗3次,每次5分钟。

10. 加入100–400 µl DAB或合适的底物,近距离检测染色进展。

11. 一旦切片染色成功,立刻将玻片浸入水中。

12. 如有需要,将切片泡在苏木精溶液中复染,按照产品说明进行。

13. 切片用蒸馏水洗两次,每次5分钟。

14. 切片脱水:

a. 95%乙醇中孵育两次,每次10秒。

b. 100%乙醇中孵育两次,每次10秒。

c. 在二甲苯中孵育两次,每次10秒。

15. 加上盖玻片。



免疫组化方法(冰冻切片)

A.     所需溶液和试剂

1. 二甲苯

2. 无水乙醇(100% 95%,变性无水乙醇,组织学级)

3. 苏木精(可选)

4. 固定剂:请参考产品说明书选取合适的固定剂。

a. 10%中性福尔马林

b. 丙酮

c. 甲醇

d. 3%甲醛溶液:配制时,将18.75 ml 16%甲醛溶液加入到81.25 ml 1X PBS中。

5. 10X Tris缓冲盐水(10X TBS):800 ml蒸馏水中加入24.2 g 三羟甲基氨基甲烷(Trizma base C4H11NO3)和80 g 氯化钠(NaCl)。用浓盐酸将pH调节到7.6

6. 漂洗(缓冲)液:1 X Tris缓冲盐水(TBS)。100 ml 10 X TBS900 ml水至1L

7. 甲醇/过氧化氢:配制时,将10 ml 30% H202加入到90 ml甲醇中。保存在-20°C

8. 封闭液:1X TBS / 0.3% Triton-X 100 / 5%正常山羊血清。配制时,将500 µl山羊血清和30 µl Triton-X 100加入到9.5 ml 1X TBS中。

9. 检测系统:根据厂家说明书使用。已有的检测系统*

10. DAB试剂或合适的底物:按产品说明配制。

 

B.      切片

1. 对于保存在-80°C的样品:切片前先从冰箱中取出放在-20°C平衡15分钟左右。这可以避免切片时样品断裂。

2. 将样品切成大约6-8 µm厚,铺在带正电性的玻片上。

3. 固定前,可以把切片摊开放在实验台上风干几分钟。(这有助于切片贴紧玻片)

 

C.     固定

注意:参考产品说明书(抗体)选择合适的固定剂

1. 玻片上的切片风干后,选用如下合适的固定剂进行固定。

a. 10%中性福尔马林:室温10分钟。立即进行染色操作。

b. 冰丙酮:-20°C 10分钟。风干。立即进行染色操作。

c. 甲醇-20°C 10分钟。立即进行染色操作。

d. 3%甲醛溶液:室温15分钟。立即进行染色操作。

e. 3% 甲醛/甲醇:先在室温下3%甲醛中固定15分钟,然后在-20°C的甲醇中固定5分钟(中间不漂洗)。立即进行染色操作。

 

D.     染色

1. 切片用漂洗液洗两次,每次5分钟。

2. 室温下,浸泡在3% H202/甲醇中孵育10分钟

3. 用漂洗液洗两次,每次5分钟。

4. 在切片上滴加封闭液,室温封闭1小时。

5. 按抗体说明书的推荐比例将抗体稀释在封闭液中。

6. 去掉切片上的封闭液,每个切片上加100-400 µl稀释的一抗。4°C孵育过夜。

7. 去掉抗体。用漂洗液洗3次,每次5分钟。

8. 根据厂家说明书,用合适的检测系统*检测。

9. 用漂洗液洗3次,每次5分钟。

10. 加入100–400 µl DAB或合适的底物,近距离检测染色进展。

11. 一旦切片染色成功,立刻将玻片浸入水中。

12. 如有需要,将切片泡在苏木精溶液中复染,按照产品说明进行。

13. 切片用蒸馏水洗两次,每次5分钟。

14. 切片脱水:

a. 95%乙醇中孵育两次,每次10秒。

b. 100%乙醇中孵育两次,每次10秒。

c. 在二甲苯中孵育两次,每次10秒。

15. 加上盖玻片。



*已有的检测系统:

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Rabbit) #8114

SignalStain® Boost IHC Detection Reagent (HRP, Mouse) #8125


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