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高手!无法想象单细胞蛋白质组学?Covaris AFA帮您实现。

版权所有,转载请联系基因市场部
2019-06-25

 

哈佛大学Budnik Bogdan、波士顿东北大学Nikolai Slavov等人在Genome Biology上发表文章通过质谱(scope-ms)开发了单细胞蛋白质组学(single cell proteomics),并验证了其基于蛋白质组识别不同人类癌症细胞类型的能力。该团队使用质谱来量化小鼠胚胎干细胞分化过程中1000多种蛋白质。文中提到单细胞蛋白质组帮助科学家能够解构细胞群并推断蛋白质丰度关系。单细胞蛋白组和转录组的比较表明,许多基因在mRNA和蛋白质水平上表现出功能上协调一致而调控模式独特的特点。

单细胞蛋白质组学研究的巨大挑战

文中提及作者面对的一大挑战就是“delivering the proteome of a mammalian cell to a MS instrument with minimal protein losses ”即"以最小的蛋白质损失将哺乳动物细胞的蛋白质组输送到MS仪器”。为了克服这一困难,作者在显微镜下获得了单个细胞,通过Covaris 聚焦超声样本处理系统分别裂解8个单细胞提取蛋白质,胰酶酶解所得的肽段分别用TMT标记,之后与另外200个细胞的蛋白提取物混合使用LC-MS/MS(Orbitap Elite)进行分析。(图1)

1 Scope-MS的概念图和工作流程。单独挑选的活细胞通过covaris超声裂解,裂解物中的蛋白质用胰蛋白酶酶解,所得肽用TMT标记,用LC-MS/MSOrbitrap Elite)组合和分析。

选择AFA技术有两种原因:

一是避免发生蛋白质降解或修饰,AFA技术可以在处理样本过程中保持持续低温的状态。

二是大多数LC-MS/MS的protocol都是用去污剂或尿素裂解细胞,由于上质谱不允许存在这些化学物质,所以必须进行脱盐处理。脱盐过程可能导致蛋白质的大量损失,使用Covaris 聚焦超声样本处理系统在同一管中进行蛋白质还原、烷基化和酶解的标准步骤时,能够在不含变性剂(如尿素、胍氯)或去污剂的情况下进行细胞裂解。避免样品稀释和脱盐,从而显著提高样品回收率。

Covaris 聚焦声波(AFA)技术

Covaris AFA聚焦超声的高频、短波、聚焦的特质(图2),可以将组织、细胞等匀浆破碎成纳米级别,从而使各种目标分子得以充分释放。传统方法裂解细胞不彻底,生物大分子形成的高级复合结构(如核糖体、染色质)没有被彻底分离,在后续实验中,会使核酸蛋白产量降低,并破坏生物信息的完整性。Covaris AFA技术可以充分破碎细胞及亚细胞结构、生物大分子复合体,最大量充分有效的释放目的分子,提高得率,并保证生物大分子完整性。



那么该如何确定只选取了单细胞呢?

为了获得单细胞,Budnik Bogdan 等先将分化的ES细胞、Jurkat细胞或U-937细胞制成细胞悬液,使用4℃的PBS稀释后估计每个样品的细胞密度,再将2ul 细胞稀释液混合于200μl的PBS中进一步稀释,为了确保只取到一个细胞,作者在显微镜下使用微量吸管在细胞稀释液中吸取一个细胞,再将细胞吐到另一个200ul PBS溶液中进行检查,确认是一个细胞之后,再使用微量细管把细胞吸出来加入到预先冷却的Covaris microTUBE-15中。在对细胞进行裂解和标记前,根据情况可以先将细胞冷冻。

这种手动的单细胞获取方法费时费力,MMI 单细胞分选技术可以全自动的挑取单细胞,通过实时录像记录挑取过程,准确、方便、快捷。

敲黑板—MMI单细胞分选技术

提及到单细胞获取,不得不敲黑板推荐MMI单细胞分选技术,功能强大,不用手动挑!不用手动挑!不用手动挑!

获取单细胞确保了实验数据的客观性和可靠性,单细胞分选技术可以帮助研究者分离出真正感兴趣的单细胞,比如,分离出循环肿瘤细胞(CTC)获得的研究结果更有意义。

众多科学家赞同的方法

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原文以SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell 为标题发布在Genome Biology (2018) 19:161

链接:https://doi.org/10.1186/s13059-018-1547-5


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