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Western Blot均一化还在用内参?No,总蛋白定量才是王道

版权所有,转载请联系基因市场部
2019-07-31

小白师妹

师兄求救!每条泳道的蛋白上样量基本上是一致的,为啥这Western Blot结果里,内参忽高忽低,跟坐过山车一样。。。。

你用的是什么内参?

资深师兄

小白师妹

我看师兄你用的Tubulin, 我就也用了跟你一样的~

你的实验样本跟我的不一样,这个内参未必适合你哦~

资深师兄

小白师妹

啊?内参不都是表达稳定的吗?为啥你的可以,我的就不可以?

任何事情都不能想当然。听我给你分析分析。

资深师兄

以下为大师兄教学内容,请认真学习哦~ 打破固定思维,拒绝理所当然

Western Blot实验中为了获得准确、可重复的结果往往需要进行均一化分析。最常用也是最经典的方法是用看家蛋白做内参进行均一化,看家蛋白又称管家蛋白,一般被认为在所有的组织中表达恒定且不受实验条件的影响,主要包括 Actin/Tubulin/GAPDH等,但是越来越多的研究表明,在某些实验条件下,例如不同的药物刺激后,不同发育阶段的样本,不同的组织来源等等生物学条件下,看家基因的表达水平都会发生变化。

早在2012年就有研究人员通过研究一组可能适合分析大鼠视网膜发育不同阶段的参考基因,来挑战看家蛋白作为合理对照的共识。研究人员在寻找一种稳定、可靠的内参蛋白,用于研究大鼠视网膜的发育,他们发现,在视网膜发育的胚胎期到产后这一阶段,肌动蛋白和微管蛋白都没有稳定表,而MAPK1这一个信号蛋白却能够稳定表达,在该实验中则可以作为内参Greer S et al.J Immunol Meth. 355:76-79(2010)。

无独有偶,Samantha Greer 等人在研究培养的正常上皮细胞和成纤维细胞中,细胞与细胞粘附引发Rac1和Cdc42(Rho家族GTP酶)活性增加的研究中发现,其引发的下游信号转导程度与细胞生长的密度有一定关联。因此在这样的实验中,重要的是使用水平不受细胞密度影响的内参作为对照。所以研究者检查了细胞密度对多种常用看家基因产物水平的影响。最终得出结论,α-微管蛋白和GAPDH随着细胞密度的升高其表达量显著增加,但在同一样品中,β-肌动蛋白和HSP90的表达量则不受影响(Rocha-Martins et al. PLoS ONE 7(8) e43028 (2012)





咱们做科研讲究的是严谨,要先筛选一种适合自己的内参,不能人云亦云啊。

资深师兄

小白师妹

听师兄这么说,真是受益匪浅。可是如果每做一个实验都要把这么多种内参试一遍,不是很麻烦么?

做科研就要不怕累,不怕苦,发挥神农尝百草的精神。

资深师兄

小白师妹

逗你的啦,其实有一种方法会更加快速可靠。那就是用总蛋白来作为对照,作为均一化的标准。总蛋白作为均一化的标准不再受生物学差异的影响,不需要在每一种生物学条件下验证蛋白是否稳定表达,是期刊杂志更推荐的一种Western Blot均一化方法。

资深师兄

小白师妹

总蛋白作为对照,怎么实现呢?

咱们使用的Odyssey这个平台,配合一款REVERT™ Total Protein Stain 的总蛋白染色试剂就可以方便的实现啦~给你看看我最近做的结果:

资深师兄

在这个实验中,使用总蛋白的信号作为校正标准就可以啦,,消除了不同生物条件下内参蛋白表达不恒定的影响;还避免了内参蛋白一抗的批间差异也会造成实验结果的重复性问题。另外REVERT™ Total Protein Stain 与蛋白是可逆结合,不影响后续抗体和目的蛋白的结合,使用也非常简单。

资深师兄

小白师妹

师兄,你说的这么好,但现在有人用这种方法吗?

当然有啦,给你看看用这个试剂发表的文章列表,其中不乏顶级期刊的高分文章哦~

资深师兄

小白师妹


嗯,太给力了!那我也要用Revert Total Protein Stain,又方便还可靠。该去哪儿买这个试剂呢?

当然是找基因有限公司啦!

资深师兄

基因有限公司是一家专业性的生命科学仪器、试剂供应商,代理超过70家欧美等地专业生产厂家。我们秉承着“让专才为专家服务”的理念,27年来坚持不懈地将最先进的技术方法引进国内,为广大客户提供专业的服务。欲了解更多完整高质量Western Blot 技术解决方案,请联系我们以及您身边的基因人。

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